qPCR外標(biāo)定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

需要做標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋，浪費(fèi)5-10個反應(yīng)孔做標(biāo)準(zhǔn)曲線，需同時擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測的樣本。

1）標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本同時擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖1.外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2）數(shù)據(jù)分析

需要繁瑣的數(shù)據(jù)整理，將待檢樣本的ct值代入標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知樣本的濃度。

無論是外標(biāo)定量，還是內(nèi)標(biāo)定量，qPCR技術(shù)的定量均需要采用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來實(shí)現(xiàn)未知濃度樣本的定量。然而，在實(shí)際情況中標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的性質(zhì)不會相同，很難保證待檢樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率達(dá)到一致。所以，qPCR定量的精準(zhǔn)性會打折。盡管qPCR具有比免疫檢測技術(shù)更高的靈敏度，從新冠疫情的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，qPCR技術(shù)需要做2-3次重復(fù)檢測，也會有一些無癥狀感染者轉(zhuǎn)陽的案例，都是因?yàn)閝PCR技術(shù)的靈敏度相對較低導(dǎo)致的。

外標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法

圖2.熒光定量PCR定量方法

數(shù)字PCR技術(shù)（dPCR）是一種核酸絕對定量技術(shù)，將反應(yīng)體系均勻分配至2萬個獨(dú)立的反應(yīng)微孔中，每個單元包含0個、1個、個別有多個目標(biāo)核酸分子，在每個反應(yīng)單元中分別對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束之后依據(jù)泊松分布原理對各個反應(yīng)單元熒光信號進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)絕對定量。

圖3.數(shù)字PCR熒光信號

紅黃藍(lán)綠各代表不同的檢測靶標(biāo)，同一張芯片可以檢測多種靶點(diǎn)

相比傳統(tǒng)熒光定量PCR，數(shù)字PCR擁有高的檢測靈敏度（是熒光定量PCR的100倍以上，降低了“漏檢"風(fēng)險）、特異性和精確性，并且無需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)定量，是真正的絕對定量技術(shù)。

數(shù)字PCR平臺定量

1）無需標(biāo)準(zhǔn)品，只需擴(kuò)增檢測未知樣本即可。

2）數(shù)據(jù)分析可視化的圖片，無需數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，直接呈現(xiàn)待檢樣本的濃度（copies/μL）。

qPCR和dPCR的差異主要在于是否需要分區(qū)檢測。qPCR不需要分區(qū)檢測，20μL反應(yīng)體積中包含待檢測的靶標(biāo)分子和反應(yīng)試劑，該反應(yīng)體系置于200μL的PCR反應(yīng)管中擴(kuò)增檢測信號；dPCR需要將20μL的反應(yīng)體積（包含待檢分子和反應(yīng)試劑）分到2萬多個體積只有1nL左右的微反應(yīng)單元，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化分割。數(shù)字PCR的分區(qū)擴(kuò)增提高了PCR檢測靈敏度和精準(zhǔn)性。

那么，如何將qPCR體系轉(zhuǎn)移到dPCR平臺，實(shí)現(xiàn)PCR檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性和靈敏度？從檢測原理上看dPCR的分區(qū)擴(kuò)增保證了PCR檢測的靈敏度和精準(zhǔn)性，而qPCR可以通過加大待檢樣本的體積來提高檢測的靈敏度和特異性，但是這種方法提高的靈敏度和特異性是有限的。目前，qPCR已經(jīng)有大量成熟的檢測試劑盒（包括科研、醫(yī)療等），而dPCR技術(shù)具有更高的檢測靈敏度和精準(zhǔn)性，如果把目前qPCR檢測體系轉(zhuǎn)移到dPCR平臺就可以更快地實(shí)現(xiàn)PCR檢測的靈敏度和精準(zhǔn)性。

實(shí)現(xiàn)該方法的轉(zhuǎn)移需要滿足3個條件：

1）qPCR試劑盒發(fā)光原理和dPCR檢測的原理一樣；

2）dPCR平臺開放，兼容第三方的試劑盒或者試劑；

3）適度的體系優(yōu)化即可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。

qPCR體系轉(zhuǎn)移到dPCR平臺會帶來2大優(yōu)勢：

1）不需要標(biāo)準(zhǔn)品，既可實(shí)現(xiàn)絕對定量；

2）提高了qPCR試劑盒檢測的靈敏度和精準(zhǔn)性。

BioDigital數(shù)字PCR“三明治"芯片，采用玻璃基底的微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)樣本的穩(wěn)定分區(qū)，保證了每個液滴的獨(dú)立性和穩(wěn)定性，具有更高的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。另外，BioDigital數(shù)字PCR平臺具有很好的開放性，支持第三方qPCR試劑盒或試劑的轉(zhuǎn)移，通過一步簡單的體系優(yōu)化甚至不需要優(yōu)化的情況下，qPCR試劑盒就可以在BioDigital平臺上實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定量。

小海龜科技BioDigital數(shù)字PCR平臺兼容性測試——兼容客戶自由的試劑盒、平臺開放

測試內(nèi)容：使用A客戶自有體系（包括檢測緩沖液、引物探針和模板）搭配小海龜數(shù)字PCR平臺進(jìn)行測試；

測試目的：使用客戶成熟的熒光定量/數(shù)字PCR檢測體系，測試其與小海龜數(shù)字PCR平臺的兼容性，協(xié)助客戶將檢測體系遷移至我們的平臺，節(jié)省體系重新開發(fā)的成本；

測試結(jié)果：重復(fù)8次測試（包括陰性和陽性），平均有效液滴數(shù)19000+，表明客戶體系與小海龜數(shù)字PCR平臺可兼容，液滴生成未受影響；下圖為測試結(jié)果（原始圖和一維散點(diǎn)圖），結(jié)果表明數(shù)字PCR腔室分割正常，陽性液滴分布均勻，一維散點(diǎn)圖陰陽性界限明顯。

小海龜科技多重?zé)晒?、低檢出限、梯度稀釋驗(yàn)證

測試內(nèi)容：使用小海龜數(shù)字PCR通用試劑盒，結(jié)合B客戶自建的檢測體系（引物探針）對小海龜數(shù)字PCR平臺進(jìn)行測試驗(yàn)證；

測試目的：測試B客戶自建體系與平臺的兼容性，并驗(yàn)證平臺檢測性能（線性、低檢出限等）；

測試結(jié)果：客戶自建引物探針體系可兼容小海龜數(shù)字PCR平臺，多重PCR體系陰陽性分簇良好。根據(jù)測試結(jié)果，小海龜數(shù)字PCR平臺在1-1000copies/μL濃度范圍內(nèi)線性度佳（R2=0.999947），低檢出限可達(dá)1copies/μL。

核酸標(biāo)準(zhǔn)品定值

測試內(nèi)容：使用C客戶自建體系，結(jié)合小海龜數(shù)字PCR通用試劑盒，對客戶提供的核酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定值；

測試結(jié)果：客戶自建體系可適配小海龜數(shù)字PCR平臺，通過多次重復(fù)測試得出待測標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2697.83±46.70copies/μL。

小海龜科技BioDigital•青 數(shù)字PCR檢測服務(wù)

1）科研服務(wù)

拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達(dá)研究、二代測序文庫定量/結(jié)果驗(yàn)證、LncRNA/circRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析（注：客戶已經(jīng)自建qPCR引物探針體系）

2）腫瘤基因檢測

已開發(fā)40余款BioDigital數(shù)字PCR液態(tài)活檢試劑盒

3）工業(yè)客戶服務(wù)

標(biāo)準(zhǔn)品定值、病毒載體定量

BioDigital•青 數(shù)字PCR檢測報告（部分?jǐn)?shù)據(jù)展示）

BioDigital•青數(shù)字PCR檢測報告展示芯片熒光信號圖、1D散點(diǎn)圖和樣本的拷貝數(shù)濃度

樣本

NTC

表2.檢測結(jié)果，軟件直接呈現(xiàn)檢測樣本的濃度